Постановка РМА (реакция макроагглютинации) на стекле при заболеваниях пчел

Используется для диагностики американского гнильца и дифференциации возбудителей других гнильцовых болезней. 

Для этой реакции необходимы: 

• бактериальный антиген 2—3-суточная культура, выделенная на плотной питательной среде;
• специфические гиперимунные сыворотки  кроликов против возбудителя американского гнильца, а при подозрении на смешанную инфекцию и против возбудителей европейского гнильца и парагнильца – нормальная кроличья сыворотка;
• предметные стекла и бактериальная петля.

Специфическую сыворотку разбавляют физиологическим раствором до рабочего разведения, которое равняется удвоен­ному предельному титру, указанному на этикетке упаковки. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю разведенной специфической сыворотки против возбудителя выделенной куль­туры гнильца, а на другом конце стекла — каплю нормальной сыворотки кролика в разведении 1:100. Готовят по 2-3 препара­та к каждой выделенной культуре возбудителя гнильца, затем в каждую каплю сыворотки на стекле вносят снятую бактерио­логической петлей микробную массу из выделенной 2—3-суточной агаровой культуры каждого исследуемого образца расплода и тщательно перемешивают петлей. РМА сопровождается кон­тролем антигена и контролем сыворотки и ставится при комнат­ной температуре (18—22  градуса). Реакцию учитывают невооружен­ным глазом или с помощью лупы (увеличение X 2).

РМА считается положительной, если в капле со специфи­ческой сывороткой через 2—4 мин.  наступает просветление и образование четкой агглютинации с образованием белых крупи­нок. В контрольной капле с нормальной сывороткой и антиге­ном — равномерное помутнение. Реакция микроагглютинации отличается высокой специфичностью. Таким образом, предлага­емая схема, включающая обнаружение характерных клиничес­ких признаков поражения расплода, проведение микроскопи­ческих и бактериологических исследований патматериала с вы­делением чистой культуры возбудителя и ее серологической иден­тификацией, позволяет ускорить анализ и установить точный диагноз на американский гнилец через 4—5 дней. При смешанной инфекции с помощью этой схемы можно дифференцировать от возбудителей других бактериальных гнильцовых болезней рас­плода пчел.

В случае получения сомнительных результатов исследований проводят идентификацию выделенных культур возбудителя аме­риканского гнильца по биохимическим свойствам. Для опреде­ления ферментативных свойств чистой культуры бациллы ларве ее высевают, а питательные среды цветного ряда смешивают с углеводами, к которым добавляют 10 % стерильной лошадиной сыворотки без консерванта. Культуру бациллы ларве на этих средах выращивают в течение 5—7 дней. Одновременно выделенные куль­туры высевают в пробирки с молоком, желатином, сывороточным МПБ с реактивами для определения сероводорода и индола.

Способность восстанавливать нитраты в нитриты изучают путем высева культуры в сывороточный МПБ с 1 % нитрата калия. После 2—3-суточного инкубирования в пробирку вносят 0,5 мл 0,5%-ного водного раствора крахмала и столько же 0,5%-ного водного раствора йодистого калия и тщательно пере­мешивают, добавляют одну каплю 5%-ного раствора серной кислоты и взбалтывают. Темно-синий цвет среды свидетель­ствует о присутствии нитрита калия. Каталазную активность определяют на предметном стекле внесением петлей в каплю 3%-ного раствора перекиси водорода суточной культуры возбу­дителя, при этом газ не выделяется. Все типичные штаммы ба­циллы Ларве медленно расщепляют глюкозу, мальтозу, маннит, не сбраживают арабинозу, ксилозу, лактозу, сахарозу, галактозу, дульцит, сорбит; разжижают желатин, свертывают и пептонизируют молоко, некоторые штаммы дают следы сероводорода. Ин­дола не образуют, восстанавливают нитраты в нитриты, не обра­зуют каталазу.

Для серологической диагностики американского гнильца разработаны методы постановки пробирочной реакции преципи­тации и реакции диффузионной преципитации (РДП) в агаровом геле. Антигеном для этих реакций служит прозрачный фильтрат из погибших личинок пчел и выросшей культуры возбудителя болезни на физиологическом растворе с добавлением 0,5 % фенола. К погибшим личинкам добавляют в десятикратном коли­честве физраствор, после тщательного растирания суспензию нагревают на кипящей водяной бане 15 мин. и экстрагируют в холодильнике 24 ч. при температуре 3—4 ° С. Затем экстракт фильтруют через асбестовую вату до получения прозрачной жидкости. Выделенную агаровую культуру возбудителя смывают физраствором, фильтруют через асбестовую вату и используют для реакции. В реакции применяют специфическую сыворотку, полученную при гипериммунизации кроликов.

В уленгутовские пробирки наливают по 0,1—0,2 мл исследуе­мого фильтрата из личинок или агаровой культуры возбудителя и подслаивают столько же преципитирующей сыворотки. Контролем для реакции являются приготовленные таким же образом фильтраты из здоровых личинок пчел или чистой культуры воз­будителя. Реакция протекает при комнатной температуре в те­чение 15 мин. При положительной реакции через 0,5—2 мин. в пробирках между слоями фильтрата и сыворотки образуется тонкое голубовато-матовое кольцо.